探針法熒光定量RT-PCR試劑盒的準備工作及使用方法
點擊次數:460 更新時間:2021-04-27
探針法熒光定量RT-PCR試劑盒使用支原體污染PCR檢測試劑盒,能在2到3小時內獲得可靠的結果,是一種靈敏度高、特異性強、快速的檢測支原體污染的方法。
探針法熒光定量RT-PCR試劑盒使用方法:
一、樣品DNA的制備
.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒DNAout。
2.如果有 N 個樣品,則需要做 N+2 個提取,包括一個陽性對照和一個陰性對照。陽性對照是在 200μL 水中加 0μL PCR 陽性對照作為陽性對照,陰性對照是直接用 200μL 水作為陰性對照。提取結束后,*得到 200μL 模板 DNA(每個樣品)放冰上待用,溶解 DNA 沉淀的溶液不能少于 200μL,否則PCR 抑制物很可能會抑制 PCR。二、PCR(60 μL 體系)
3.樣品管:在 N+2 個PCR 管中加入下列成分:成分 N 個樣品管 陰性對照 陽性對照PCR MagicMix 3.0 各 20 μL 20 μL 20 μL PCR 引物對 各 2 μL 2 μL 2 μL 樣品 DNA 模板 各 8 μL - - 陽性對照(純化后) - 8 μL - 陰性對照(純化后) - - 8 μL電泳檢測
4.取 0-20 μL PCR 產物直接進行瓊脂糖凝膠電泳(本產品不需要單獨加loading buffer),*使用 00 bp DNA Marker,如果樣品為陽性,將會得到長度為 3582 bp 的擴增產物。
二、探針法熒光定量RT-PCR試劑盒的準備:
待各組份融化后先瞬時離心,然后輕彈混勻。按下表在已滅菌的PCR管中配制反應體系,每次實驗需加一個陰性和一個陽性對照,測試反應管可以有多個。配制過程中應注意無菌,并注意避免操作產生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染,在有風壓的設備如超凈臺或生物安全柜中進行操作。建議配制完畢后瞬時離心以使液體沉至管底。