還原型(GSH)樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 準確稱取0.g組織或收集500萬細胞,加入mL試劑一和0uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿 600g,4℃離心5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,00g,4℃離心0min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的 NOX(此步可選做)。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔0秒,重復30次),用于NOX活性測定。
血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至600nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
()試劑四于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入0μL樣本、200μL試劑四和40μL試劑五,混勻,記錄600nm處20s時吸光值A和min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A-A2。
NOX 活力單位的計算
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
、血清(漿)NOX活力的計算:
單位的定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.0定義為一個酶活力單位。
NOX(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.0÷T=2500×ΔA
2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:
()按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A600變